牛奶中雌性激素对雄性SD幼鼠血脂代谢的影响

该文已刊登在《实用儿科临床杂志》2009, 24(20), 1601-1603.

通讯作者：徐庄剑，教授，硕士生导师，研究方向：小儿内分泌

庞兴甫1，徐庄剑1，马亚萍1，陈小南2，张文杰1，王 勍1江南大学附属医院儿科徐庄剑

（苏州大学附属第四医院1儿科；2检验科，江苏 无锡，214062） 

Effects to Blood Lipid of Female Sex Hormones in Cow’s Milk in Young Male SD Rat

PANG Xing-fu,XU Zhuang-jian,MA Ya-ping,CHEN Xiao-nan,Zhang Wen-jie,Wang Qing

(1 Department of Pediatrics; 2 Department of Clinical Laboratory, The 4th Affiliated Hospital of Soochow University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China)

摘要: 目的  研究牛奶中雌性激素对雄性SD幼鼠血脂代谢的影响。方法  48只21日龄雄性SD幼鼠随机等分为4组，分别定量喂食妊娠奶牛奶、市售纯牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶。于53日龄时应用全自动生化分析仪检测各组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 和尿肌酐(Cr)；应用免疫化学发光法检测血清孕酮(P4)、尿游离雌三醇(UFE3)。结果  妊娠奶牛奶、市售纯牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶乳清中的总雌二醇(pmol/L)分别为1189.66、833.98、588.17和286.48；P4(nmol/L)分别为9.76、10.18、2.83和0.92；血清TC(mmol/L)分别为1.78±0.29、1.94±0.20、2.10±0.28和2.11±0.22，产后奶牛奶和实验配方奶组均分别与妊娠奶牛奶组差异有统计学意义(P <0.05)；4组血清TG、HDL-C、LDL-C、P4和UFE3/Cr差异均无统计学意义。结论  妊娠奶牛奶可能对雄性SD幼鼠有降血清TC作用，其机理可能与雌二醇和P4联合作用有关。

关键词：牛奶；雌二醇；雌三醇；孕酮；血脂；雄性幼鼠

Effects to Blood Lipid of Female Sex Hormones in Cow’s Milk in Young Male SD Rat

Abstract: Objective  To investigate the effects of female sex hormones in cow’s milk on metabolism of blood lipid in young male Sprague-Dawley(SD) rat. Methods  Forty eight male Sprague-Dawley rats aged 21 days old were assigned randomly to 4 groups, each containing 12 rats, and fed with quantitative milk from postpartum cow, milk from pregnant cow, commercial whole milk and artificial milk respectively. Serum total cholesterol (TC), triglyeride (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and urinary creatinine (Cr) were determined by automatic biochemical analyzer. Serum progesterone (P4)and urinary free estriol (UFE3) were determined by immunochemiluminometric assays after all rats were killed at 53 days old. Results  Total estradiol (pmol/L) and P4 (nmol/L) were 1189.66, 833.98, 588.17, 286.48 and 9.76, 10.18, 2.83, 0.92 in milk from pregnant cow, commercial whole milk, milk from postpartum cow and artificial milk groups, respectively.No differences were observed in serum TG, HDL-C, LDL-C, P4 and UFE3/Cr between groups. Serum TC (mmol/L) were respectively(1.78±0.29), (1.94±0.20), (2.10±0.28) and (2.11±0.22) in pregnant milk, commercial whole milk, postpartum milk and artificial milk group, and TC in pregnant milk group was lower than that in postpartum milk group or artificial milk group (P<0.05) respectively. Conclusions  Milk from pregnant cow may reduce serum TC in young male SD rat, which may be related to the conjoined effect of estradiol and P4.

Keywords: cow’s milk; estradiol; estriol; progesterone; blood lipid; young male rat

食源性雌性激素与人类健康的研究日益受到重视，而雌性激素又是影响人类血脂水平的重要因素。目前牛奶中雌性激素的增加[1]与人类健康关系的研究主要集中于成人激素相关性肿瘤的流行病学调研[2,3]和动物发育[4,5]影响等，但其对人类血脂的影响及其相关动物实验研究甚少，尤其是儿童及相关动物研究。本研究旨在观察牛奶中雌性激素水平对雄性幼鼠血脂代谢的影响，为开展相关动物实验和临床研究提供动物实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用奶及其储存  (1)妊娠奶牛奶：采集2头妊娠奶牛(妊娠210和230天)奶混匀。(2)市售纯牛奶：从市场购买同一品牌10个不同批号的市售纯牛奶，拆装混匀。(3)产后奶牛奶：采集3头产后奶牛(产后30~32天)奶混匀。(4)实验配方奶(详见1.2.2)。除实验配方奶为现配现用外，其余三种奶均-20℃冰箱储存备用。

1.1.2 实验动物  48只19日龄清洁级雄性SD幼鼠购自浙江省实验动物中心，合格证号为SCXK(浙)2003-0001 。

1.1.3 主要实验设备及试剂  ACCESS全自动微粒子免疫化学发光分析仪(美国BECKMAN公司，DxI800)及配套试剂检测雌性激素；全自动生物化学分析仪(日本HITAC公司，HI7170A)及配套试剂检测血脂；硫酸酯酶购于美国SIGMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 奶液中蛋白质、脂肪和乳糖的测定  采用凯氏定氮(Kjeldah method)、哥里特－罗兹法(Rose-Gettlieb method)和还原糖直接滴定法(Direct Titration method of Reducing Sugar)，分别检测妊娠奶牛奶、市售纯牛奶和产后奶牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖的水平。

1.2.2 实验配方奶配制  根据产后奶牛奶、妊娠奶牛奶和某市售纯牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖水平检测结果，在配制实验配方奶时使其蛋白质、脂肪和乳糖分别与上述三种牛奶中各成分最高者对应相同，并分别由谷朊粉、椰子油和碳水化合物代替，同时添加主要维生素和微量元素[6]，应用物理方法使其呈液态且均一稳定。同时在上述三种牛奶中添加不同比例的蛋白质、脂肪和乳糖使4组的各成分对应相同，以保证4组奶液能量摄入处于相对平衡。

1.2.3 奶液中总雌二醇(total estradiol, TE2)和孕酮(progesterone, P4)的测定  采用免疫化学发光法(Immunochemiluminometric assays, ICMA)检测乳清TE2，奶液中的雌二醇(estradiol, E2)有游离型和结合型两种形式，因此需先用硫酸酯酶水解法将结合型E2转变为游离型E2，再检测样本中TE2含量[4]。具体方法为：将妊娠奶牛奶、市售纯牛奶和产后奶牛奶各2mL，高速离心(14 000r/min)90min，抽取乳清各0.45mL，分别加入0.5mL乙酸钠缓冲液后，再加入0.05mL硫酸酯酶溶液(含25U硫酸酯酶的0.4%氯化钠溶液)，在37℃水浴下孵育21h，检测上述混合液(乙酸钠为100mmol/L，氯化钠为0.02%)中的E2，TE2质量浓度 =所测浓度÷0.45。乳清中的P4采用ICMA法直接检测。

1.2.4 动物实验步骤  48只19日龄清洁级雄性SD幼鼠称量体质量后编号，采用实验动物完全随机分组法(随机数字表法)随机等分为妊娠奶牛奶、市售纯牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶组，置动物房适应环境2天，温度(20±2)℃，一鼠一笼，由专人采用特制负压喂奶瓶(自制)定量喂奶，分别喂食妊娠奶牛奶、市售纯牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶，并定期称量幼鼠体质量。由于幼鼠进奶量逐日增加，开始7天每只予10mL/d，随后10天予20mL/d，最后15天予30mL/d，在规定的奶量完成后自由取食鼠饲料和水。实验从幼鼠第21天开始至第53天结束。

1.2.5 幼鼠处死前的取材及检测  于48~50日龄，分3批(采用随机法分批)采用代谢笼收集4组幼鼠24h尿[(21.20±6.59)mL]，留5mL置–80℃储存备测尿游离雌三醇(urinary free estriol,UFE3)。第53天时，水合氯醛麻醉后心脏抽血2mL，离心(3000r/min) 15min后取血清，应用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyeride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和尿肌酐(creatinine, Cr)水平。因本研究预实验时发现血清E2均低于ICMA可报告范围水平下限，故检测UFE3来反映体内雌激素水平。UFE3和血清P4采用ICMA检测。

1.3 统计学处理  采用SPSS13.0软件进行分析。计量资料用 表示。各组实验数据均进行正态性检验(Kolmogorov-Smirnov法)和方差齐性检验(Levene法)，4组数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，均数间两两比较采用多个样本均数间的两两比较(Student-Newman-Keuls检验)。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 奶液中TE2和P4  妊娠奶牛奶、市售纯牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶中的TE2(pmol/L)分别为1189.66、833.98、588.17和286.48；P4(nmol/L) 分别为9.76、10.18、2.83和0.92。在喂饲各种奶液的32天中，妊娠奶牛奶、市售奶牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶组平均摄入乳清的TE2[ng/(kg·d)]分别为43.40、30.43、21.46和10.45；其平均摄入乳清的P4 [ng/(kg·d)]分别为411.16、428.57、119.20和38.84。

2.2 血清和尿中的激素  上述4组血清P4浓度(nmol/L)分别为(58.07±18.88)、(56.84±20.88)、(60.48±17.53)和(63.67±24.98)，差异无统计学意义(H＝1.082,P＝0.781)；UFE3/Cr分别为(2.21±2.14)×10-6、(1.35±0.51) ×10-6、(2.04±1.19) ×10-6和(1.97±1.73) ×10-6，差异无统计学意义 (H＝2.725,P＝0.436)。

2.3 实验结束时的体重和尾长  妊娠奶牛奶、产后奶牛奶、市售纯牛奶和实验配方奶组的体质量(g)分别为(293.00±18.06)、(287.17±28.62)、(297.50±34.27)和(308.00±22.80)，(F=1.310,P=0.283)；尾长(cm)分别为(18.68±0.73)、(18.63±0.97)、(18.82±0.73)和(19.06±0.86)，(F=0.644,P=0.591)。4组体质量和尾长差异均无统计学意义。

2.4 实验结束时的幼鼠血脂检测结果  见表1。

表1 各组幼鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平( , mmol/L)

此处排表1

3 讨论

近年来，随着血脂异常相关性疾病的年轻化，儿童血脂水平及其相关疾病的研究已逐步引起学术界的关注。冠心病的病理改变早在儿童期就已出现，并与增高的血浆TC及TG水平呈正相关。日本磐田市和我国部分地区儿童流行病学调查显示，前者TC水平[7]及后者血脂水平[8,9]均有逐年上升趋势。金红芳等[10]流行病学调查显示北京地区肥胖儿童血TC和TG显著高于正常儿童。

目前外源性E2对血脂代谢的影响主要集中于药源性E2对大鼠血脂代谢的研究，且因研究对象和方法等不同而不同。梁东明等[11]研究显示E2[皮下注射，0.2mg/(kg·d)，14周]可使去势1周后雄性大鼠(10周龄)血浆TC、TG、HDL-C和LDL-C水平升高。Parini P等[12]研究表明较大剂量的E2[皮下注射，0.2-4mg/(kg·d)，7天]可降低8~9周龄雌性大鼠TC水平，而生理剂量的E2[皮下注射，≤0.04mg/(kg·d)，7天]则可升高HDL-C和TC水平，且口服不同水平的E2也有类似作用。周淑青等[13]研究显示雌激素(倍美力，0.86mg/kg·d，灌胃，50天)可升高去卵巢15天后(12周龄)大鼠血清HDL-C水平，而TC、TG和LDL-C水平均降低。

牛奶中的E2若摄入体内应属于外源性的食源性E2。在喂饲各种奶液的32天中，本研究妊娠奶牛奶、市售奶牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶组平均摄入乳清的TE2[ng/(kg·d)]分别为43.40、30.43、21.46和10.45，而牛奶中的雌激素包括雌酮、E2和E3三种，乳清中三者的比例分别约为7:2:1[4]，按此比例计算，上述前3组摄入的乳清雌激素总量[ng/(kg·d)]分别为217.00、152.15和107.30，纯牛奶的脂肪和酪蛋白中也含有相当量的雌激素，如市售纯牛奶与其乳清中17-βE2比例为6.4:1.5[14]，即使将乳清、脂肪和酪蛋白中的雌激素均计算在内，前3组摄入的雌激素总量仍均在上述生理剂量范围。但妊娠奶牛奶组血清TC水平(均低于产后奶牛奶和实验配方奶组)提示妊娠奶牛奶对雄性幼鼠可能有一定的降TC作用。然而，根据上述药源性E2对大鼠血脂代谢的研究，只有较大剂量的E2才有降TC作用，而生理剂量很难达到。由此可见，妊娠奶牛奶的此种降TC作用难以仅用雌激素来解释。

但是，妊娠奶牛奶中除含有较高的E2，还含有较高的P4。在喂饲各种奶液的32天中，本研究妊娠奶牛奶、市售奶牛奶、产后奶牛奶和实验配方奶组平均摄入乳清的P4 [ng/(kg·d)]分别为411.16、428.57、119.20和38.84，可见妊娠奶牛奶和市售奶牛奶P4含量明显高于产后奶牛奶和实验配方奶。有研究显示绝经后妇女雌孕激素联合治疗4个月后血清HDL-C水平升高，TC水平降低，TG和LDL-C无显著改变 [15]。在儿童或幼年动物中尚未见雌孕激素联合作用的研究报道。因此，本研究妊娠奶牛奶的降血清TC作用有可能是雌孕激素联合作用所致。血TC水平增高是血脂异常相关性疾病的危险因素之一，妊娠奶牛奶的降血清TC作用对雄性SD幼鼠血脂异常相关性疾病的发生也有可能具有保护作用，而此作用是否有幼鼠性别或干预的日龄差异及对儿童的影响如何等，尚待进一步研究。

大约75％的市售牛奶来源于妊娠奶牛奶[4]，本研究妊娠奶牛奶和市售奶牛奶中的TE2和P4水平几乎相当，也支持此观点。但市售奶牛奶组血清TC未能像妊娠奶牛奶一样，却分别与产后奶牛奶和实验配方奶组无差异，且4组血清TG、HDL-C、LDL-C、P4和UE3/Cr均无差异，有可能需扩大样本等进一步研究。

参考文献：

[1]    袁丽君，徐庄剑，胡瑜等.部分牛奶中的雌二醇和孕酮含量[J].中国食品卫生杂志,2007,19(2): 139-141.

[2]    Ganmaa D,Sato A.The possible role of female sex hormones in milk from pregnant cows in the development of breast,ovarian and corpus uteri cancers[J].Med Hypotheses,2005,65(6): 1028-1037.

[3]    Qin LQ,Wang PY,Kaneko T,et al.Estrogen:one of the risk factors in milk for prostate cancer[J]. Med Hypotheses,2004,62(1):133-142.

[4]    Ganmaa D,Qin LQ,Wang PY,et al.A two-generation reproduction study to assess the effects of cows' milk on reproductive development in male and female rats[J].Fertil Steril,2004,82(suppl 3):1106-1114.

[5]    袁丽君,徐庄剑,胡 瑜,等.牛奶中雌性激素样物质对雌性幼鼠尿雌三醇和孕酮的影响[J].现代预防医学,2007,34(23):4498-4501.

[6]    胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M].7版.北京:人民卫生出版,2002:113.

[7]    Kouda K,Nakamura H,Tokunaga R,et al.Trend in levels of cholesterol in Japanese children from 1993 through 2001[J].J Epidemiol,2004,14(3):78-82.

[8]  刘 颖,米 杰,杜军保.北京地区6～l8岁儿童血脂紊乱现况调查[J].中国实用儿科杂志,2007,22(2): 101-102.

[9]    唐芳雪,潘建平,田亚平,等.西安市学龄前儿童血脂水平分析[J].第四军医大学学报,2008,29(19): 1814-1816.

[10]金红芳，米 杰，杨晓征，等.北京地区肥胖儿童青少年血脂状况调查[J].实用儿科临床杂志，2008，23（13）：997-999.

[11]梁东明,王建昌,李 源,等. 雌、雄激素对雄性大鼠血脂代谢及肝血脂代谢相关酶的影响[J].中国老年学杂志,2007,27(12):1121-1124.

[12]Parini P,Angelin B,Stavre´us-Evers A,et al.Biphasic effects of the natural estrogen 17beta-estradiol on hepatic cholesterol metabolism in intact female rats[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(7):1817-1823.

[13]周淑青，戚爱群，虞和永.替勃龙对去卵巢大鼠血脂的影响[J].中国医院药学杂志，2007，27（8）：1174-1175.

[14]Wolford ST,Argoudelis CJ.Measurement of estrogens in cow's milk,human milk,and dairy products[J].J Dairy Sci,1979,62(9):1458-1463.

[15]Bednarek-Tupikowska G,Tworowska-Bardzinska U,Tupikowski K.Effects of estrogen and estrogen-progesteron on serum nitric oxide metabolite concentrations in post-menopausal women[J].J Endocrinol Invest,2008,31(10):877-881.

表1 各组幼鼠血清TC、TG、HDL和LDL水平 ( , mmol/L)

Table 1 The leveles of serum TC, TG, HDL-C and LDL-C in all groups ( , mmol/L)

检测项目

妊娠奶牛奶组

市售纯牛奶组

产后奶牛奶组

实验配方奶组

F

P

TC

1.78±0.29

1.94±0.20

2.10±0.28*

2.11±0.22*

4.610

0.007

TG

1.19±0.47

1.21±0.83

1.22±0.64

1.07±0.65

0.129

0.943

LDL-C

0.20±0.05

0.17±0.06

0.23±0.05

0.19±0.04

2.144

0.108

HDL-C

0.71±0.14

0.68±0.12

0.79±0.11

0.67±0.10

2.491

0.073

与妊娠奶牛奶组相比*P<0.05。TC：血清总胆固醇；TG：血清甘油三酯；HDL-C：血清高密度脂蛋

白胆固醇；LDL-C：血清低密度脂蛋白胆固醇。

*P<0.05, vs. pregnant milk group. TC:  total cholesterol; TG: triglyeride; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol.